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                来源:www.mrsmoobooks.com ;时间:2017-11-11

                >>>栀子八氢番茄红素分解酶基因的分别及表白分析作者:原创论文网时间:2014-01-1410:52摘要:为探讨栀子(Gardeniajasminoides)果实中藏花素的分解机理,克隆了栀子类胡萝卜素生物分解的关键酶八氢番茄红素分解酶(GjPSY)基因的全长cDNA。结果表明,推导的GjPSY氨基酸序列与双子叶动物泉源的GjPSY亲缘关联较近。采用HPLC检测栀子果实中的藏花素-1含量为(±)mgg1,在叶片中未检出。

                经由过程RT-PCR分析表明,GjPSY在栀子叶片跟果实中均有表白,且表白水平一致。

                是以推想,GjPSY的转录水平与果实中藏花素-1的分解有关。

                  关键词:栀子;阿朴类胡萝卜素;藏花素;八氢番茄红素分解酶;基因表白1资料跟措施资料跟试剂栀子(Gardeniajasminoides)植株培养于广东药学院。收罗栀子成熟叶片跟花后16周的栀子果实,果肉为橙色。

                一切资料贮存于80℃。CreatorTMSMARTTMcDNA文库构建试剂盒购自Clontech公司。PrimescriptonestepRT-PCR试剂盒购自TaKaRa年夜连公司。藏花素-1(Crocin-1)的对比品购于Sigma-Aldrich公司。乙腈、甲醇为色谱纯,别的生化试剂等为分析纯。  藏花素-1含量的测定以改良的HPLC测定栀子叶片跟果实中藏花素-1(Crocin-1)的含量。叶片跟果实在液氮中研磨后以50%(V/V)的甲醇-水溶液提取,在超声处理处分30min后以10000g离心10min,取上清液在20℃下贮存。HPLC分析时,上清液以滤膜过滤,以DiamonsilTMC18(2)柱(,5m)(Dikma公司,中国)分析,梯度洗脱。  仪器为Waters2995HPLC仪(Waters公司,美国),装备2996光电二极管阵列检测器检测。数据分析图1Crocin的生物分解途径。IPP:异戊烯焦磷酸;DMAPP:二甲基丙烯焦磷酸;GPP:喷鼻叶基焦磷酸;GGPP:喷鼻叶基喷鼻叶基焦磷酸。:Isopentenyldiphosphate;DMAPP:Dimethylallyldiphosphate;GPP:Geranyldiphosphate;GGPP:  Geranylgeranylpyrophosphate.第5期441以Empower2软件实现。洗脱前提为:10%~20%乙腈溶液(乙腈/水,V/V),0~20min;20%~50%乙腈溶液,20~25min,流速为1mLmin1,检测波长440nm。目的峰经由过程与藏花素-1对比品的保留时间跟接收光谱的对比而确定。经由过程尺度曲线确定藏花素-1的含量,共停止3次重复试验。  基因的克隆以CTAB(Hexadecyltrimethylammoniumbromide)法提取栀子果实中的总RNA。依照CreatorTMSMARTTMcDNA文库构建试剂盒的仿单从总RNA构建栀子果实的cDNA文库。将获得的SMART双链cDNA克隆接入pDNR-LIB载体并转化年夜肠杆菌(Escherichiacoli)DH-5。  依据动物八氢番茄红素分解酶基因PSY的保守区计划简并引物,F1:5-ATHTGGGCNATHTAY-GTNTGG-3跟F2:5-RAARTTRTTRTARTCRTTN-GCYTC-3,从cDNA文库的细菌裂解液中扩增PSY基因。获得了GjPSY基因的中央片断,将该片断回收并测序,命名为GjPSY-M。依据GjPSY-M片断序列分别计划5端特异引物GSP1:5-GCGATA-CAACAATAGCGATGCCCATACAG-3跟3端特异引物GSP2:5-GTGCAGGAGAACGGATGAGC-TGGTT-3,配合文库构建试剂盒供给的5端跟3端的质粒检测通用引物,采用RACE措施从cDNA文库中获得GjPSY基因的5端跟3端序列。获得的片断分别命名为5GjPSY跟3GjPSY,将片断回收跟测序并停止序列分析,与GjPSY-M拼接出GjPSY的全长cDNA。依据全长GjPSY序列,经过BLAST比对跟开放浏览框(ORF)序列分析,分别计划引物F1:5-CGCCATTAATATGTCTGTCGCTTTGC-TATGGGTTG-3跟F2:5-ATGCTCGAGGGCCTT-TGCTAGTGGAGATGATGTTCT-3,从cDNA文库的细菌裂解液中扩增获得GjPSY的ORF序列。  基因的表白分析从栀子果实跟叶片平分别提取总RNA,采用PrimescriptonestepRT-PCR试剂盒停止RT-PCR分析,回声所用GjPSY特异引物分别为F1:5-GAC-ATACTTGCTGGAAAGGTCAC-3跟F2:5-GCTA-GTGGAGATGATGTTCTTGG-3。以组成性表白的RPS25-1基因(40S核糖体小亚基卵白25-1基因,GenBank登录号:GU797554)为内参,RPS25-1基因的特异引物分别为F1:5-CAGAAGAAGAAGA-AGTGGAGCAA-3跟F2:5-TGGTAGCTCTGGT-GTATATCTGC-3。RT-PCR回声法式为:95℃2min,接着94℃30s,55℃30s,72℃1min,共30次轮回,末了72℃延伸7min。扩增产物用%琼脂糖凝胶电泳检测。  2结果栀子叶片跟果实中藏花素-1的含量应用甲醇-水溶液提取栀子叶片跟果实中的藏花素-1,提取液用于HPLC分析。经由过程与crocin-1对比品的保留时间跟接收光谱停止对比,在果实样品中不雅察到crocin-1峰,在叶片样品中未不雅察到crocin-1峰(图2)。同时,检测到果实中crocin-1的含量为(±)mgg1。  基因的克隆为了克隆GjPSY基因,构建了栀子果实的cDNA文库,以简并引物从cDNA文库中扩增获得GjPSY基因cDNA的中央片断GjPSY-M,长度为688bp。接着经由过程5RACE获得了长度为1596bp的5GjPSY片断;经由过程3RACE获得了长度为956bp的3GjPSY片断。将5GjPSY、GjPSY-M跟3GjPSY共3个片断序列停止拼接,获得全长cDNA,长度为1876bp。依据全长序列从cDNA文库中扩增获得ORF序列(图3);经序列分析,此全长cDNA含有1314bp的ORF,5端非翻译区为393bp,3端非翻译区为169bp,命名为GjPSY(GenBank登陆号:HQ599860)。猜测GjPSY基因编码的卵白质含有437个氨基酸,分子量为,等电点为。  的序列分析GjPSY的氨基酸序列经BLAST分析,结果表明,GjPSY与多种动物的八氢番茄红素分解酶的序列相似,它们均含有两个保守的富含天冬氨酸的模体DXXXD。这个模体被觉得可经由过程Mg2+联合于底物的焦磷酸基团,在八氢番茄红素分解酶催化两个GGPP分子缩合的回声中施展重要感化。  采用ClustalW2软件对相似度较高(相似度为55%~93%)的18条来自多种动物的八氢番茄红素分解酶序列进高蓝等:栀子八氢番茄红素分解酶基因的分别及表白分析442热带亚热动员物学报第21卷行同源退化比对,采用软件构建氨基酸序列的NJ(Neighbor-joining)系统退化树,用重复1000次的自展支持率(Bootstrap)检验各分支的相信值。结果表明,GjPSY与中粒咖啡的PSY最为相似,与番茄跟拟南芥PSY的相似度均年夜于来自禾本科的玉米及水稻的。而在与玉米跟水稻的各3种PSY的比对中可知,GjPSY与PSY1最为相似,而与PSY3关联最远。  的表白分析分别提取栀子叶片及果实中的总RNA,采用RT-PCR法分析GjPSY的表白水平。以组成性表白的RPS25-1为内参。结果表明,GjPSY的转录水平在叶跟果实中表现一致。  3批评辩论类胡萝卜素是异戊烯类色素,在动物的光互助用跟光保护感化中施展感化,是人体中重要的营养物资,是维生素A的前体。由类胡萝卜素衍生的阿朴类胡萝卜素,如藏花酸跟藏花素既可作为色素应用,也存在药用感化。有研究表明,藏花素跟藏花酸存在防止动脉粥样硬化、抗炎、抗细胞增殖、防备视网膜变性、神经保护感化跟改良胰岛素抵御等感化。八氢番茄红素分解酶是类胡萝卜素生物分解中的第一个限速酶,PSY基因在票据叶跟双子叶动物中普遍存在基因复制现象,这个基因家属中各个基因的表白往往存在构造特异性,或对情况钳制等身分孕育产生应答。今朝对多种动物的PSY基因的分别、表白及转基因动物的分析研究旭日东升。  在柑橘果实中,PSY基因跟着果实的成熟表白上调,分歧种类上调幅度分歧,可见柑橘的PSY栀子果实的甲醇-水提取液的HPLC图谱。主峰是crocin-1,检测波长440nm,插图为crocin-1的在线接收光谱。A:果实;B:crocin-1对比品。  :Fruits;B:  栀子GjPSY基因的PCR扩增图谱。M:DL2000marker;1:GjPSY-ORF。  :DL2000marker;1:GjPSY-ORF表白形式与GjPSY分歧。番茄中有两个PSY基因:  PSY1跟PSY2,它们均在幼苗、成熟叶片及果实中表白。PSY1在幼苗跟果实成熟前期的表白高于PSY2,而PSY2重要在成熟叶片中表白,推想PSY1是由PSY2经基因扩增孕育产生的平行同源基因。GjPSY的氨基酸序列与番茄的PSY2的氨基酸序列较相似(相似度达81%,与PSY1的相似度为75%),而且在果实中的表白水平与叶中邻近,提醒它不是与果实成熟相干的基因。两个番茄PSY1突变体,一个是W180*无义突变,一个是一个氨基酸调换突变体P192L,对它们果实中的类胡萝卜素的含量跟比例停止了分析。W180*的果实为黄色果肉,直到成熟颜色都不产生变更,代谢分析表明在果实中没有类胡萝卜素,其PSY1卵白掉去活性,证实PSY1是独一在果实成熟过程中施展感化的PSY。P192L果实也为黄色,直到破色期后的第3天赋转为赤色,这是因为八氢番茄红素分解的削减形成番茄红素跟-胡萝卜素的积累耽误,其PSY1卵白的活性被抑制。与GjPSY的氨基酸序列比对表明,W180*产生突变的氨基酸对应于GjPSY的W204,P192L突变体的氨基酸相当于GjPSY中的P216,这两个氨基酸均在两个DXXXD模体之间,且在多种动物的PSY中高度保守。  木薯中的两个PSY基因在分歧构造中的表白也不相同,叶中PSY1跟PSY2均有高水平的表白,在根跟花药中的表白水平均较低,但根中PSY2的表白是PSY1的10倍。别的,木薯的PSY1可对高盐钳制响,PSY2中的单碱基突变导致的单氨基酸突变(A191D)可使木薯根中的类胡萝卜素含量进步20倍。A191氨基酸位于两个DXXXD图4来自分歧动物的18个PSY的亲缘关联图谱。节点上的数字为重复1000次的自展支持率(Bootstrap)。子叶跟果实中GjPSY基因的转录水平等:栀子八氢番茄红素分解酶基因的分别及表白分析444热带亚热动员物学报第21卷模体之间的较保守的地区。本研究中分析的来自12种动物的18条PSY氨基酸序列中A191均为丙氨酸。GjPSY的氨基酸序列与木薯PSY2的相似度为76%,与PSY1相似度为74%,所以更接近PSY2。但从以上与番茄跟木薯的序列比对及表白分析回难以明确判断GjPSY的功效。  玉米、高梁、小麦跟水稻各有3个PSY基因,都编码有功效的八氢番茄红素分解酶。小麦中的3个PSY基因中,只要PSY1与面粉的黄色素含量有关,PSY2只获得了部门序列,PSY3的启动子区存在可应答零落酸ABA的顺式感化元件。其PSY1的表白与籽粒中类胡萝卜素的积累正相干,PSY2则与叶中类胡萝卜素的分解相干,在叶中表白最多。PSY3在未受到钳制的叶中的表白比PSY1跟PSY2低,在根中稍多一点。在外源ABA且受钳制的根中,3种PSY的表白均有增加,以PSY3的增加最多,即PSY3对ABA的回声远年夜于PSY1跟PSY2。与小麦的对比分析也难以判断GjPSY的种类跟感化。玉米的PSY1重要在叶片跟胚乳中表白,并与胚乳中类胡萝卜素的积累呈正相干关联;其PSY2的表白则与光引诱的脱黄化过程正相干;PSY3在根跟胚乳中年夜量表白,可被干旱、高盐跟外源ABA处理处分所引诱。水稻胚乳中不含类胡萝卜素,3种PSY基因在胚乳中都无表白;而在停止光互助用的构造中,3种基因都有表白。  水稻的OsPSY1跟OsPSY2在根跟叶中的表白均高于OsPSY3,其中OsPSY1跟OsPSY2均受光调控,OsPSY1表白最多。OsPSY3不被光引诱但在根中的表白可被高盐或干旱所引诱。经由过程分析水稻、玉米跟拟南芥的PSY基因的结构及它们的启动子区,觉得OsPSY1是票据叶跟双子叶动物的陈旧PSY基因的遗存,OsPSY2跟OsPSY3均是OsPSY1的平行同源基因。是以,咱们推想GjPSY相当于玉米跟水稻中的PSY1。  参考文献[1] MachidaK,OyamaK,IshiiM,:[J].ChemPharmBull,2000,48(5):746748.  [2] KaziHA,ationofNFkB[J].SaudiJGastroenterol,2009,15(3):181187.  [3] MehriS,AbnousK,MousaviSH,PC12cells[J].CellMolNeurobiol,2012,32(2):227235.上一篇:下一篇:重要提醒:转载本站信息须注明泉源:原创论文网,具体权责及申明请参阅网站申明。浏览提醒:请自行判断信息的实在性及不雅点的正误,本站概不卖力。他人都分享了,你还在等什么?赶快分享吧!。

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